慢病毒系列|让你“为所欲为”调控基因（CRISPR/Cas9文库篇）
CRISPR/Cas9系统及其应用
随着CRISPR/Cas9手艺的兴起，，，，，，实现了对动植物基因组编辑的普遍应用。。。CRISPR/Cas9手艺源自Ⅱ型CRISPR/Cas系统，，，，，，Cas9是一种核酸内切酶，，，，，，双tracrRNA:crRNA设计成为单向导序列（sgRNA），，，，，，其5’端的20个核苷酸序列通过碱基互补配对原则与靶位点的DNA连系，，，，，，3’端与Cas9卵白连系。。。sgRNA与DNA靶序列特异性连系，，，，，，使Cas9能够在特异性位点使靶细胞基因组DNA双链断裂（如图1）。。。随后，，，，，，靶细胞通过非同源端毗连爆发InDels，，，，，，实现基因敲除； ；或提供dsDNA供体模板通过同源重组修复的要领实现基因的定点突变或是基因插入。。。对Cas9卵白要害活性位点D10A和H840A举行突变后，，，，，，使Cas9损失催化活性但不影响其与目的DNA序列连系的能力。。。这种突变的Cas9卵白被称为dCas9，，，，，，可应用于CRISPR激活（CRISPRa：dCas9与单个转录激活因子VP64毗连可激活目的基因），，，，，，亦可用于CRISPR滋扰 (CRISPRi：dCas9与转录抑制子KRAB融合后连系到靶基因TSS位点抑制转录起始，，，，，，默然靶基因的表达) 。。。
图1：CRISPR/Cas9系统的事情流程
Jennifer A. Doudna et al., Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096.
CRISPR/Cas9系统操作简朴，，，，，，可针对任何感兴趣的靶基因设计差别的sgRNA，，，，，，且拥有奇异的DNA切割机制、多重靶点识别能力等特点，，，，，，能够准确、高效地靶向、编辑、修改、调理和标记种种细胞和生物的基因组位点。。。CRISPR/Cas9系统的降生，，，，，，使碱基编辑、转录调控和表观遗传编辑、基因组规模的筛选以及细胞和胚胎治疗等方面获得普遍的生长和应用，，，，，，CRISPR/Cas9文库的应用也让基础研究中大规模的基因组编辑和筛选成为现实。。。在筛选功效增益方面CRISPRa较量有用； ；在筛选缺失功效方面CRISPRi文库较RNAi文库更有用。。。
慢病毒载体是CRISPR/Cas9系统的主要载体之一，，，，，，因慢病毒有适用宿主规模广、熏染效率高、具有生物清静性、整合基因到宿主细胞实现恒久稳固表达的特点，，，，，，可实现CRISPR/Cas9文库对靶细胞有用且准确的基因编辑。。。下面就一起来相识慢病毒载体和CRISPR/Cas9相关的基因编辑系统怎样应用于基础研究。。。
案例1——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（全基因组文库）
Elaiophylin triggers paraptosis and preferentially kills ovarian cancer drug-resistant cells by inducing MAPK hyperactivation
作者单位：华中科技大学同济医学院
IF:38.104
细腻调理的丝裂原活化卵白激酶(MAPK)信号通路对癌细胞的存活很主要。。。经前期化合物库的筛选确定了茶叶素是一种自噬抑制剂。。。在本研究中证实晰茶叶素在多种癌细胞中通过太过激活MAPK通路诱导内质网应激、内质网衍生的细胞质空泡化以及随后的细胞凋亡的作用。。。CRISPR/Cas9全基因组敲除文库筛选判断出MAPK通路中的SHP2是茶叶素诱导细胞凋亡的要害靶点。。。细胞热位移实验(CETSA)和外貌等离子体共振(SPR)实验进一步证实了SHP2与茶叶素直接连系。。。通过SHP2敲低或药理抑制SHP2/SOS1/MAPK通路显着削弱了茶叶素诱导的细胞凋亡和自噬抑制。。。茶叶素通过触发细胞凋亡来战胜耐药性，，，，，，这提醒茶叶素可能为难治性卵巢癌提供一种合理的治疗战略。。。
图2：全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛流程及茶叶素诱导自噬抑制示意图。。。
Guan-Nan Li et al., Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022 Sep 12;7(1):317.
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案例2——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（激活文库）
Genome-wide CRISPR screen identifies MTA3 as an inducer of gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarci
作者单位：天津医科大学肿瘤医院
IF:9.756
临床胰腺导管腺癌(PDAC)治疗失败的主要缘故原由之一是爆发吉西他滨(GEM)耐药。。。作者通过CRISPR/Cas9激活文库筛选发明MTA3介导了PDAC的GEM耐药，，，，，，因此MTA3可能成为潜在联合化疗的治疗靶点。。。CRISPR文库筛选显示MTA3是GEM处置惩罚后存活细胞中富集最多的基因，，，，，，生物信息学和组织学剖析提醒其与GEM耐药高度相关。。。体内外实验均证实MTA3可增进胰腺癌细胞对GEM的耐药。。； ；粕希，，，，，MTA3作为Mi-2/核小体重塑和去乙； ；缸家种聘春衔锏淖槌刹糠郑，，，，，抑制NF-κB/p65的转录抑制因子CRIP2的转录，，，，，，激活NF-κB信号通路，，，，，，从而导致GEM耐药。。。别的，，，，，，GEM可通过激活STAT3信号通路上调PDAC细胞中MTA3的表达，，，，，，从而诱导PDAC对GEM爆发获得性耐药。。。MTA3在胰腺癌GEM耐药中起要害作用，，，，，，有望成为逆转GEM耐药的治疗靶点。。。
图3：使用CRISPR激活文库筛选MTA3作为潜在的GEM耐药相关基因。。。
Liangliang Wu et al., Cancer Lett. 2022 Aug 15;548:215864.
★文库泉源：人类CRISPR激活文库购置自Addgene(#1000000078)
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案例3——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（lncRNA激活文库）
Lnc-DC promotes estrogen independent growth and tamoxifen resistance in breast cancer
作者单位：杭州医学院隶属人民医院
IF:9.685
选择性雌激素受体调理剂(SERMs)—他莫昔芬已被证实在雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的治疗中是有用的。。。然而，，，，，，这种内渗透治疗的主要障碍是雌激素非依赖性生长导致的耐药，，，，，，其潜在机制尚不完全清晰。。。本研究探讨了长链非编码RNA (lncRNAs)是否加入调控ER阳性乳腺癌的雌激素非依赖性生长和他莫昔芬耐药。。。研究基于CRISPR/Cas9的SAM(协同激活介质)文库确定了候选Lnc-DC。。。通太过析批注，，，，，，Lnc-DC能够通过上调抗凋亡基因Bcl2和Bcl-xL来镌汰他莫昔芬诱导的细胞凋亡。。。别的，，，，，，Lnc-DC通过磷酸化(pSTAT3Y705)激活STAT3，，，，，，随后诱导细胞因子的表达而激活STAT3，，，，，，形成自渗透环路。。。临床上，，，，，，Lnc-DC高表达与患者不良预后相关，，，，，，本研究证实Lnc-DC/STAT3/细胞因子轴在雌激素非依赖性生长导致他莫昔芬耐药中的功效，，，，，，Lnc-DC可能是他莫昔芬应答的潜在展望因子。。。
图4：判断Lnc-DC加入雌激素非依赖性和他莫昔芬耐药。。。
Wan-Xin Peng et al., Cell Death and Disease. 2021 Oct 25;12(11):1000.
★文库泉源：双载体SAM文库，，，，，，购置自Addgene(#61426、#61425)
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案例4——慢病毒＆CRISPR/Cas9文库（定制文库）
Targeting euchromatic histone lysine methyltransferases sensitizes colorectal cancer to histone deacetylase inhibitors
作者单位：德国癌症研究中心(DKFZ)
IF:7.316
结直肠癌(CRC)一个主要的特征是表观遗传失调。。。针对晚期癌症，，，，，，表观遗传药物与抗肿瘤药物连系是一种有远景的治疗战略。。。作者使用合成致死的看法来识别与组卵白去乙； ；(HDAC)抑制剂协同作用以降低CRC生长的表观遗传靶点。。。研究使用针对614个表观遗传调理因子定制sgRNA文库举行CRISPR/Cas9筛。。。，，，，，发明敲除常染色质组卵白赖氨酸N-甲基转移酶1和2 (EHMT1/2)显著增强了临床使用的HDAC抑制剂的抗增殖作用。。。通过对1066例差别肿瘤分期的结直肠癌样本举行组织芯片剖析，，，，，，发明EHMT2卵白在晚期结直肠癌低表达，，，，，，且与不良临床下场相关。。； ；粕希，，，，，协同抑制HDAC和EHMT1/2可引起镌汰肿瘤细胞生长的差别机制，，，，，，包括细胞周期阻滞和自噬的调理。。。表观遗传水平上，，，，，，这些化合物增添H3K9乙； ；，，，，，降低H3K9二甲基化。。。功效表型上，，，，，，协同抑制HDAC和EHMT1/2可降低患者泉源的CRC类器官肿瘤的活力。。。
图5：聚焦CRISPR/Cas9筛选确定EHMT1和EHMT2敲除对HDAC抑制剂的增敏作用。。。
Leonhard Valentin Bamberg et al., Int. J. Cancer. 2022;151:1586–1601.
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