【Science Advances】一脚踢开重组卵白：mRNA增进骨再生应用远景可观
前言
长骨节段性缺损较难愈合一直是阻碍骨再生医学生长的主要问题。。。。。重组卵白临床应用价钱腾贵且用量多副作用大，，，已经不可知足日益提高的医疗需求。。。。。美国梅奥康复医学中心联合MERLN立异再生医学研究所的团队克日在Science Advances揭晓了题为‘Efficient healing of large osseous segmental defects using optimized chemically modified messenger RNA encoding BMP-2’的文章。。。。。文中应用通过化学修饰的mRNA替换重组卵白递送到大鼠骨折部位增进骨重修再生，，，为骨愈合治疗提供了一种立异、清静、可转化的手艺。。。。。
配景先容
骨形态爆发卵白(bone morphogenetic protein，，，BMP)，，，是一组具有类似结构的高度守旧的功效卵白，，，属于TGF-β家族。。。。。BMP能刺激DNA的合成和细胞的复制，，，增进MSCs定向分解为成骨细胞。。。。。它照旧体内诱导骨和软骨形成的主要因子，，，并在肢体生长、骨折早期、软骨修复时表达，，，对骨骼的发育和再生修复起到主要作用。。。。。
再生医学为修复骨缺损和爆发再生骨提供了新的解决计划。。。。。重组人骨形态爆发卵白-2（rhBMP-2）等重组卵白类新药已被批准在美国使用，，，但该类新药展现出的治疗效果却差强人意。。。。。寻找一种高效清静的局部基因递送要领成为更具有远景的研究思绪。。。。。
mRNA是基因和其编码卵白之间的前言。。。。。与DNA疗法差别，，，不保存插入突变或其他遗传损伤的危害。。。。。编码特异性治疗卵白的合成mRNA容易制备，，，并且可以通过廉价的非病毒载体递送到细胞内。。。。。但mRNA的不稳固性、细胞毒性和炎症特征阻碍了其在再生医学中的应用，，，对mRNA举行结构修饰和脂质载体递送同样也是现在研究重点。。。。。
文章中研究者评估了一种化学修饰的mRNA（cmRNA）编码的BMP-2修复大鼠股骨严重节段性缺损的能力。。。。。新生骨显示出与自然骨相当的力学性能，，，且没有重组卵白使用后形成的大宗骨痂。。。。。该研究提醒了转录疗法在加速骨愈合方面的有用性和清静性。。。。。
研究内容
01
为了研究化学修饰的mRNA（cmRNA）的清静性和体内药物代谢，，，研究者对中段骨缺损的大鼠原位注射了携带萤火虫荧光素酶Fluc的cmRNA并举行活体成像，，，在除治疗部位外的其他身体部位未视察到荧光。。。。。给予cmRNA治疗后，，，体内爆发大宗的BMP-2卵白，，，注射后第5天，，，卵白质表达衰减至低水平。。。。。相比之下，，，应用重组人BMP-2卵白在第1天抵达高点后就最先逐渐削弱。。。。。该研究提醒局部应用cmRNA的可行性及cmRNA药物代谢的优势。。。。。
Figure 1. Single application of FLuc cmRNA induces robust and localized luciferase activity in the bone but is absent from the circulation and essential organs.
02
研究者接下来对cmRNA应用的剂量依赖性举行了探讨。。。。。当原位给予25ug及以上的cmRNA时爆发的BMP-2卵白能够愈合骨缺损。。。。。给药4周后，，，25ug的cmRNA剂量下骨愈合率为50%，，，50ug的剂量下动物骨缺损完全愈合。。。。。并且在使用cmRNA的愈合历程中，，，未视察到rhBMP-2引起的大宗异位骨痂形成。。。。。μCT效果显示cmRNA组和rhBMP-2组新生骨小梁更薄，，，骨小梁厚度、数目和骨小梁疏散度均相似。。。。。rhBMP-2组在治疗4-8周历程中保存骨丧失加速的征象，，，而cmRNA组则体现稳固。。。。。提醒了应用cmRNA治疗的可取性。。。。。
在力学方面，，，愈合会恢复长骨的失效扭矩值。。。。。cmRNA组在治疗4周时恢复了自然骨的失效扭矩值，，，而此时rhBMP-2组的失效扭矩值仍然显著低于正常。。。。。8周时，，，仅cmRNA组的失效扭矩显著高于正常骨组。。。。。这批注cmRNA的作用可能使骨机械强度恢复更快。。。。。
Figure 2. Bone healing with BMP-2 cmRNA is dose-dependent; doses >25ug are necessary to heal critically sized bone defects reliably in rats.
03
研究者应用PCR芯片对cmRNA及rhBMP-2影响的成骨和基质形成相关基因举行了批量检测，，，效果显示二者均刺激了骨细胞外基质要害因素胶原、骨毗连卵白及转化生长因子等转录本上调。。。。。同时加入骨重塑的酶如基质金属卵白酶和组织卵白酶K也上调，，，提醒骨缺陷修复历程中矿化组织情形的高度活跃。。。。。而只有cmRNA影响II型和X型胶原的转录本。。。。。II型胶原是软骨细胞的标记，，，X型胶原是软骨细胞肥大和软骨内骨化的标记。。。。。因此治疗方法的差别会导致骨愈合历程的差别，，，cmRNA引起软骨内骨化，，，rhBMP-2引起膜内骨化。。。。。
Figure 3. Expression of relevant osteogenic and extracellular matrix–related genes in newly formed tissue.
04
组织学检查证实cmRNA组和rhBMP-2组在4周和8周时骨缺损被桥接。。。。。Masson和HE染色均显示有皮质和骨髓重修的新骨天生。。。。。与cmRNA组相比，，，rhBMP-2组骨痂体积更大，，，皮质的修复却不显着，，，提醒了cmRNA应用的清静性更好。。。。。cmRNA在较低浓度时能够增强X型胶原的表达，，，并刺激间充质前体的软骨形成，，，但无法进一步增进软骨内成骨。。。。。加大剂量到50ug后增进软骨内成骨继续到骨形成。。。。。cmRNA处置惩罚后TRAP阳性面积比显著增添，，，局部IL-17A和RANKL表达增添，，，批注与rhBMP-2相比，，，cmRNA治疗组织重塑效果更好。。。。。
Figure 4. BMP-2 cmRNA administration induces de novo bone deposition in the defect.
05
研究者又通过免疫组化发明经cmRNA治疗骨缺损中保存II型和X型胶原。。。。。这些胶原的表达在低剂量cmRNA治疗的骨缺损组别中最高。。。。。而II型胶原在50ug cmRNA治疗后期的缺损中已不可见，，，推测是由于足量cmRNA加速软骨内骨化修复。。。。。低剂量应用cmRNA治疗后X型胶原的表达弱于II型胶原，，，无法继续增进软骨内骨化。。。。。经50ug cmRNA处置惩罚的缺损在4周时X型胶原已不显着，，，证实足量的cmRNA治疗爆发的II型和X型胶原能够加速修复历程。。。。。
Figure 5. Collagen type II deposition and chondrocytic cells are only visible within defects administered BMP-2 cmRNA,Collagen type X is clearly visible 4 weeks after BMP-2 cmRNA treatment but decreases at 8 weeks.
06
为了评估骨缺损治疗中局部炎症因子爆发情形，，，研究者在手术和应用cmRNA或rhBMP-2后的差别时间，，，测定外周血中种种炎症因子、肿瘤坏死因子及抗炎因子的浓度。。。。。模子组和rhBMP-2治疗组没有发明细胞因子的增添。。。。。而在cmRNA治疗组中，，，细胞因子水平显著升高。。。。。单独使用非编码cmRNA会增添细胞因子的爆发。。。。。当使用目的基因的cmRNA时，，，诱导炎症作用进一步增强。。。。。其中对促炎细胞因子IL-1a的诱导作用特殊强。。。。。而比照cmRNA组诱导炎症的水平在第1天较低，，，所有组别细胞因子升高均在术后1天抵达峰值，，，并一连至少10天。。。。。
Figure 6. Circulating cytokines elevated as a result of cmRNA application.
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