Nat Commun | JAK抑制剂或可解决玄色素瘤免疫疗法耐药问题
?前言
2022年8月，，，，阿拉巴马大学伯明翰分校Lewis Shi团队在Nature Communications揭晓“Selective suppression of melanoma lacking IFN-γ pathway by JAK inhibition depends on T cells and host TNF signaling”，，，，该研究使用IFNγR1敲除的玄色素瘤细胞，，，，构建免疫检查点阻断剂（immune checkpoint blocker, ICB）耐药小鼠模子，，，，发明ICB耐药的潜在靶点JAK1/2，，，，其抑制剂以T细胞和肿瘤坏死因子依赖的方法选择性抑制IFN-γ信号缺失的玄色素瘤。。。。
配景先容
ICB是恶性肿瘤治疗领域的重大突破，，，，尤其是在玄色素瘤中。。。。肿瘤细胞会通过控制免疫检查点卵白，，，，如CTLA-4、PD-1、PD-L1等，，，，来逃阻止疫监视。。。。ICB则通过阻断免疫检查点，，，，在肿瘤浸润T细胞（tumor-infiltrating T cell, TIL）中增强免疫效应功效，，，，并且降低免疫抑制的FoxP3+调理性T细胞（Treg）的品貌，，，，从而实现对肿瘤的抑制。。。。
只管云云，，，，仍有许多患者对ICB治疗耐受，，，，其中一个主要缘故原由是肿瘤细胞IFN-γ信号缺失，，，，现在尚缺乏针对ICB耐药的治疗战略。。。。肿瘤内IFN-γ信号在ICB抗肿瘤功效中是必需的，，，，但在作者的前期研究中，，，，对玄色素瘤敲低IFNγR1（IFNγR1KD）却并没有显着改变TIL中CD8+/Treg比例，，，，这可能由于细胞中仍有剩余的IFN-γ信号。。。。作者思量使用CRISPR手艺对IFNγR1举行敲除，，，，进而探讨战胜ICB耐药的潜在靶点。。。。
研究思绪
01 构建IFNγR1敲除的玄色素瘤细胞系，，，，以及移植瘤小鼠模子，，，，验证模子能够有用模拟IFN-γ信号缺失导致的ICB耐药。。。。
02 从肿瘤免疫微情形剖析ICB耐药，，，，检测IFN-γ信号缺失对TIL的影响，，，，发明IFN-γ信号缺失使肿瘤内T细胞特征镌汰。。。。
03 使用激酶组剖析寻找可能的ICB耐药靶点，，，，发明IFN-γ信号缺失的玄色素瘤细胞中JAK1/2激酶通路的激活。。。。
04 划分从胞外和胞内探讨JAK1/2通路激活的因素，，，，找到PI3K-Akt和mTOR信号通路，，，，通过差别抑制剂处置惩罚等证实mTOR在上游调控JAK1/2通路。。。。
05 体内验证JAK1/2抑制剂可以通过T细胞和TNF因子依赖的方法特异性阻碍IFN-γ信号缺失的玄色素瘤生长。。。。
研究内容
首先，，，，作者使用CRISPR-Cas9手艺在B16细胞中敲除IFNγR1（IFNγR1KO），，，，并接种至BL6小鼠中构建玄色素瘤小鼠模子。。。。履历证IFNγR1KO细胞对IFN-γ的刺激没有响应，，，，体现为JAK2磷酸化、Irf1、PD-L1、MHC-I/II等在IFN-γ刺激下均没有上调，，，，别的IFN-γ也不可诱导IFNγR1KO细胞凋亡或抑制其细胞增殖。。。。IFNγR1的敲除自己对B16细胞体内成瘤能力没有影响，，，，但IFNγR1KO玄色素瘤对CTLA-4抗体的处置惩罚耐受。。。。与体外数据一致，，，，体内IFNγR1KO玄色素瘤经CTLA-4抗体治疗后，，，，PD-L1和MHC-II等表达也没有上调。。。。
接下来作者剖析IFNγR1KO玄色素瘤中的TIL表型。。。。流式发明CD8+ T细胞的基数镌汰，，，，并且CTLA-4抗体治疗不会像比照玄色素瘤那样，，，，增添T细胞浸润、镌汰瘤内Treg细胞比例、或增进效应细胞因子渗透等等。。。。对TCGA数据库中玄色素瘤举行剖析，，，，凭证IFNGR1表达量分为两组，，，，发明IFNGR1低表达的玄色素瘤中T细胞特征基因表达降低，，，，包括T细胞外貌标记物、效应分子和MHC分子等，，，，同时IFNGR1低表达的玄色素瘤患者生涯率也显著降低。。。。相比于皮肤玄色素瘤（SKCM），，，，葡萄膜玄色素瘤（UVM）对免疫磨练点抑制剂（ICB）越发耐受，，，，数据库批注UVM中IFNGR1表达，，，，以及T细胞特征基因表达更低。。。。
思量到酪氨酸激酶在IFN-γ信号中的主要作用，，，，作者对IFNγR1KO细胞举行了激酶组活性剖析，，，，试图在其中寻找战胜ICB耐药的靶点。。。。这一剖析发明激活的激酶网络搜集到JAK1/2，，，，WB验证IFNγR1KO细胞JAK1/2及其下游STAT3的磷酸化水平升高，，，，而在IFNγR1KO细胞重新表达Ifngr1后，，，，JAK1/2磷酸化水平回调，，，，说明玄色素瘤中IFN-γ信号的缺失与JAK1/2异常激活保存联系。。。。
JAK-STAT通路可能由胞外信号如IFN-γ、IFN-α/β、IL-6等激活。。。。Il6、Il6r以及IFNαR1（IFN-α/β受体）在IFNγR1KO细胞中表达升高，，，，但IL-6和IL-6R抗体处置惩罚，，，，或敲除Ifnar1均不可使IFNγR1KO细胞的JAK1/2磷酸化水平降低，，，，说明不是这些因素使JAK1/2激活。。。。进一步剖析其他胞外因素，，，，作者用IFNγR1KO细胞的作育基上清处置惩罚比照玄色素瘤细胞，，，，发明并不可诱导JAK2磷酸化水平上升，，，，因此IFNγR1KO细胞JAK1/2的激活更可能是胞内事务的效果。。。。
为了明确使JAK1/2的激活胞内因素，，，，作者对IFNγR1KO和比照细胞举行了全转录组测序，，，，使用差别表达基因举行通路富集剖析，，，，并且举行了磷酸化卵白质组学研究。。。。这些剖析均发明PI3K-Akt和mTOR信号通路的显著差别，，，，WB验证了IFNγR1KO细胞中AKT和4E-BP1（mTOR下游）磷酸化水平升高。。。。作者进一步研究JAK1/2与mTOR通路的关系。。。。mTOR抑制剂rapamycin (Rapa)处置惩罚IFNγR1KO细胞显著抑制JAK2磷酸化，，，，而JAK1/2抑制剂ruxolitinib (Ruxo)处置惩罚后4E-BP1磷酸化水平稳固，，，，并且在IFNγR1KO细胞中敲低mTOR也能使JAK1/2磷酸化回调。。。。因此，，，，在IFN-γ信号缺失的玄色素瘤细胞中，，，，mTOR通路信号增强，，，，并调控下游JAK1/2的激活。。。。
上述效果提醒IFN-γ信号缺失导致的ICB耐药或允许以通过靶向mTOR-JAK1/2来解决，，，，作者随后在B6小鼠中举行体内验证。。。。在用Ruxo划分处置惩罚IFNγR1KO和比照玄色素瘤小鼠模子后，，，，发明Ruxo仅特异性抑制IFNγR1KO玄色素瘤生长。。。。只管云云，，，，体外实验批注这一抑制作用并非由Ruxo对IFNγR1KO细胞的直接杀伤所致。。。。对体内玄色素瘤的剖析显示，，，，Ruxo能够镌汰CD4+ TIL中Treg细胞比例，，，，增添TNF、IFN-γ、穿孔素、IL-2的渗透。。。。而从未经药物处置惩罚的玄色素瘤中疏散TIL举行体外作育，，，，发明Ruxo处置惩罚降低FoxP3表达，，，，增强TIL的效应功效。。。。以上效果批注Ruxo依赖于TIL施展对IFN-γ信号缺失的玄色素瘤的抑制作用，，，，而非直接杀伤肿瘤细胞。。。。
为了评估T细胞在Ruxo治疗中的作用，，，，作者对接受Ruxo治疗的IFNγR1KO玄色素瘤小鼠举行CD4或CD8中和抗体处置惩罚，，，，发明任一种T细胞的缺失都使Ruxo的治疗无效。。。。在对Ruxo抑癌效应机制的探讨中，，，，作者关注到TNF。。。。IFNγR1KO玄色素瘤细胞接种至TNF敲除（TNF-/-）小鼠后，，，，Ruxo不可将其抑制。。。。对TIL的剖析也发明，，，，TNF-/-小鼠中Ruxo处置惩罚不可使Treg细胞比例下降，，，，或使IFN-γ、IL-2等因子渗透增添。。。。因此，，，，Ruxo对IFNγR1KO玄色素瘤的特异性抑制依赖于T细胞和TNF因子。。。。
综上所述，，，，文章使用IFNγR1敲除的玄色素瘤小鼠模子，，，，发明IFN-γ信号缺失的玄色素瘤免疫微情形更倒运于抑制肿瘤；；连系激酶组、转录组、磷酸化卵白质组等多组学剖析，，，，发明此类玄色素瘤中mTOR通路信号增强，，，，从而激活下游JAK1/2激酶；；JAK或允许以作为IFN-γ信号缺失所致ICB耐药的靶点，，，，对临床有一定的指导意义。。。。
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