【Molecular Cancer】水师军医大学与上海九院研究新突破：更清静的基因编辑系统
CRISPR-Cas9基因编辑手艺具有普遍的潜在未来应用，，，，包括癌症治疗[1]。。。。。。现在，，，，CRISPR-Cas9手艺的主要清静性问题是宿主对其组分的免疫反应[2-3]和脱靶问题[4]。。。。。。然而，，，，该手艺在RNA水平的清静性问题尚未获得评估。。。。。。
RNA和MicroRNAs(miRNAs)之间保存普遍的相互作用，，，，不但爆发在mRNA的3’非翻译区域，，，，也爆发在mRNA的氨基酸编码序列(CDSs)中[5]。。。。。。越来越多的研究发明，，，，一种长链RNA可以通过“miRNA海绵”机制连系和吸附与其部分互补的miRNA，，，，上调被这些miRNA抑制的靶基因[6]。。。。。。
近期，，，，水师军医大学王越团队、上海交通大学医学院隶属第九人民医院秦兴军/王业飞团队与美国南加州大学应其龙团队相助在Molecular Cancer杂志上揭晓题为Optimization of Cas9 RNA sequenceto reduce its unexpected effects as a microRNA sponge的文章，，，，文中研究了外源性长链核酸物质Cas9 RNA是否会通过miRNA海绵机制影响宿主细胞基因表达，，，，并开发了RNA序列优化战略，，，，以提高该基因编辑系统的清静性[7]。。。。。。
效果
01 Cas9 RNA通过miRNA海绵机制影响细胞内基因表达
为了剖析Cas9对其细胞内自己保存的microRNAs及其靶基因的调控作用，，，，研究职员首先挖掘了一个数据库，，，，其中包括过表达Cas9及其对应亲本比照的331个细胞系的转录组信息。。。。。。作者使用miRanda软件剖析了Cas9 RNA和所有已知的人类miRNA之间的连系可能性。。。。。。
研究职员将展望与Cas9 RNA连系可能性最高的51个miRNAs被命名“Cas9-miRNAs”(图1A-B)，，，，而69个不与Cas9连系的miRNAs被命名为“non-Cas9-miRNAs”。。。。。。凭证microRNA海绵假说，，，，在某种细胞中引入Cas9后，，，，某“Cas9-miRNA”的靶基因中，，，，可能保存有更多靶基因表达水平上调的趋势。。。。。。研究者发明在这331个细胞系中，，，，大大都“Cas9-miRNAs”的靶基因在更多的细胞中保存上述趋势，，，，切合microRNA海绵假说；；；；而“non-Cas9-miRNAs”的靶基因就不保存这样的趋势。。。。。。这个效果从CRISPR研究领域上讲，，，，提醒Cas9的RNA可以通过microRNA海绵机制施展作用；；；；从RNA相互作用的的基础机制角度上讲，，，，该研究使用几百种细胞系中，，，，简单的，，，，相同干预设计的大样本数据证实晰microRNA海绵机制自己的普遍性，，，，虽然在许多细胞中这种效应并不是很是强。。。。。。
在联合剖析miRNA基础表达数据库（CCLE）中的数据后，，，，研究者发明在所有的Cas9-miRNA中，，，，Let-7i是大大都细胞中主要表达的Cas9-miRNA。。。。。。且Let-7家族成员是众所周知的肿瘤抑制miRNA，，，，因此研究者后续研究将注重力集中在了Cas9的RNA对let-7家族及其下游靶基因的研究中。。。。。。通过qPCR和Western Blot实验，，，，研究职员证实了在更多类型的细胞中引入Cas9后，，，，一些验证过的let-7靶基因表达上调(U251, 786-O, T98G v.s. MCF7) (图1I-J) 。。。。。。
别的，，，，研究者还将let-7i的靶基因转变切合microRNA海绵假说趋势的细胞界说为let-7i相关Cas9敏感细胞，，，，反之为let-7i相关Cas9不敏感细胞；；；；比照这两类细胞发明，，，，miRNA自己的表达量和靶基因的基础表达量，，，，以及靶基因的突变状态都会影响Cas9的RNA施展microRNA海绵效应。。。。。。这不但有助于评价Cas9在某种细胞中是否通过microRNA海绵效应施展作用，，，，也为更普遍的microRNA海绵效应是否保存于某种细胞提供一定预判参考。。。。。。
进一步，，，，作者剖析了其他几种Cas9 RNA通过microRNA海绵机制加入let-7家族靶基因的调控，，，，通过RNA-pulldown实验证实Cas9 RNA可以直接连系let-7(图1N)，，，，并且证着实一些肿瘤细胞中，，，，一些let-7靶基因在Cas9导入后有一定水平上调，，，，如CDK6、KRAS、FN1和HMGA(图1O)。。。。。。在Cas9转基因小鼠中，，，，虽然在大大都作者检测的组织中没发明显著差别，，，，但在少数组织中保存let-7靶基因上调的征象。。。。。。以上实验效果批注，，，，Cas9 RNA在某些类型的细胞中可以通过miRNA海绵机制调控let-7靶基因，，，，提醒Cas9表达系统自己可能通过DNA裂解以外的机制影响细胞。。。。。。
图1 Cas9 RNA通过miRNA海绵机制影响细胞内基因表达
02 Cas9 RNA序列优化降低其对细胞增殖和let?7下游基因的影响
Let-7下游靶基因大部分为癌基因，，，，由于Cas9可以调控一些let-7靶基因的表达，，，，研究职员推测外源引入Cas9可能会影响细胞的生物学特征。。。。。。作者将Cas9病毒载体和比照病毒转入人前线腺癌细胞系DU145，，，，发明Cas9在细胞计数中轻度增进细胞增殖和细胞集落形成（图1A）。。。。。。在体内实验中，，，，研究职员也发明Cas9轻度增进肿瘤细胞的生长(图2B)。。。。。。
Cas9 RNA可以通过miRNA海绵机制稍微增进某些细胞的增殖，，，，提醒除了降低CRISPR-Cas9系统的脱靶效应外，，，，有须要通过修改Cas9自己的RNA来提高CRISPR-Cas9手艺的清静性。。。。。。为了进一步证实这一miRNA海绵机制的保存且在RNA水平上优化Cas9序列，，，，研究职员构建了一个同义突变质粒Cas9-Mut，，，，在三个let-7连系位点爆发突变，，，，而Cas9-mut的mRNA转录本可以被翻译成与Cas9相同的氨基酸序列(图2F)。。。。。。HEK293细胞的RNA-pulldown实验显示，，，，Cas9-mut与let-7的连系比Cas9显着镌汰(图2G)。。。。。。
研究职员发明，，，，在DU145细胞(图2J-K)和U251细胞中(图2L)，，，，Cas9-mut上调let-7靶基因的能力也显着弱于Cas9。。。。。。研究者将Cas9-Mut质粒和靶向UBXN4基因的gRNA转入DU145细胞，，，，进一步测试证实了Cas9-Mut的基因编辑能力(图2O)，，，，为其在现实应用中提供了支持。。。。。。
图2Cas9 RNA序列优化降低其对细胞增殖和let?7下游基因的影响
结论
研究职员通过生物信息学剖析和实验效果批注，，，，Cas9的RNA可以通过miRNA海绵机制与内源性miRNA相互作用，，，，Cas9 RNA可以通过连系let-7，，，，上调一些let-7的靶基因，，，，并在某些细胞类型中轻度增进细胞增殖。。。。。。通过同义突变let-7连系位点，，，，可以优化Cas9的RNA序列，，，，削弱其对细胞增殖和部分let-7下游基因的表达的增进作用。。。。。。研究者重新的维度熟悉了CRISPR/Cas9手艺的清静性问题，，，，并提出相识决计划，，，，提供了在RNA水平上优化的更清静的CRISPR/Cas9手艺，，，， 有一定的应用远景。。。。。。
水师军医大学的蒋俊锋，，，，曾韬，，，，张莉和范杏飞为文章的第一作者。。。。。。
参考文献：
[1]Zhang H, et al. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer.2021;20(1):126.
[2] Chew WL, et al. A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response.Nat Methods. 2016;13(10):868–74.
[3]Charlesworth CT, et al. Identification of preexisting adaptive immunity toCas9 proteins in humans. Nat Med. 2019;25(2):249–54.
[4]Kleinstiver BP, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleaseswith no detectable genome-wide off-target effects. Nature.2016;529(7587):490–5.
[5]Tay Y, et al. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulateembryonic stem cell differentiation. Nature. 2008;455(7216):1124–8.
[6]Xiao G, et al. The long noncoding RNA TTTY15, which is located on the Ychromosome, promotes prostate Cancer progression by sponging let-7.Eur Urol. 2019;76(3):315–26.
[7]Junfeng Jiang,et al.Optimization of Cas9 RNA sequenceto reduce its unexpected effects as a microRNAsponge.Mol Cancer.2022 Jun 24;21(1):136.doi: 10.1186/s12943-022-01604-x.
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