创伤后的心肌成纤维细胞退！退！退！
前言
2022年1月美国华盛顿大学Jennifer Davis研究团队在Cell Stem Cell上揭晓问题为“MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing”的心血管研究文章，，，，，该研究发明心脏创伤后愈合历程中MBNL1能够驱动成纤维细胞和肌成纤维细胞之间的动态转换 。。。。该发明为逆转心脏创伤后心肌纤维化的历程提供了新的解决思绪 。。。。配景先容
心脏疾病的焦点问题是康健的心肌组织被纤维化的疤痕组织所替换 。。。。虽然创伤后自我修复形成的瘢痕可避免心肌梗死后心脏破损，，，，，但它会引起血流动力学障碍和心律失常最终导致心脏衰竭 。。。。瘢痕的形成源于Tcf21和Pdfgra系的心脏固有成纤维细胞的动态转变，，，，，这些成纤维细胞在损伤后增殖，，，，，然后转化为肌成纤维细胞 。。。。有研究批注，，，，，肌成纤维细胞的状态现实上是不稳固和可逆的，，，，，取决于前纤维性刺激后未知分子机制的运作 。。。。
MBNL（musclebind-like protein）盲肌样卵白家族是一类RNA连系卵白，，，，，MBNL1通过稳固、剪接、聚腺苷酸化和定位靶mRNA调理转录 。。。。有研究批注肌强直性营养不良以及红细胞和肌成纤维细胞发育缺陷与MBNL1介导的创伤后愈合失调有关 。。。。MBNL1基因敲除的小鼠损伤后肌成纤维细胞密度和纤维化疤痕均降低 。。。。
在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的历程中，，，，，所需的转虑谰如血清反应因子（SRF）和钙调神经磷酸酶（CnA）被MBNL1稳固或交替拼接 。。。。这些研究均批注MBNL1在增进心脏纤维化状态和纤维化中起着主要的作用 。。。。
亮点要素
1.MBNL1调控心脏成纤维细胞终态并调理瘢痕形成和成熟
2.MBNL1调理心肌梗死诱导的心脏成纤维细胞的增殖
3.MBNL1是诱导和维持成熟的肌成纤维细胞状态的要害分子
4.MBNL1能够稳固成纤维细胞激活（纤维化）状态下的转录本
研究思绪
通过批量的转录组测序发明MBNL1在激活的肌成纤维细胞中上调，，，，，并在心肌梗死修复历程中与成纤维向肌成纤维细胞状态的转变相切合，，，，，确定MBNL1在细胞动态转换之间起到主要作用 。。。。（确定基因）
构建MBNL1过表达心脏成纤维细胞特异性转基因鼠与MI模子鼠，，，，，FACS分选心脏成纤维细胞并测序，，，，，发明MBNL1能够使肌成纤维细胞相关的转录本上调 。。。。又在MBNL1过表达的基础上构建MI模子小鼠，，，，，接纳胶原及增殖荧光染色等要领，，，，，明确了MBNL1抑制MI诱导成纤维细胞增殖并稳固瘢痕的作用 。。。。（基因up验证）
构建MBNL1条件性敲除小鼠，，，，，通过染色及心脏超声发明MBNL1缺失在心梗情形下镌汰纤维化及肌成纤维细胞增殖、减轻心室扩张、改善缩短功效 。。。。与比照小鼠相比，，，，，敲除小鼠成纤维细胞分解缺陷且纤维化瘢痕组织形成不良，，，，，又通过熏染过表达SRF腺病毒恢复了转化为肌成纤维细胞的能力 。。。。（基因down验证）
对MBNL1缺失的MI小鼠心脏举行单细胞测序剖析各细胞生长情形，，，，，发明MBNL1缺失后MI小鼠心脏重新安排了损伤后修复的系统 。。。。其中与纤维化有关的基因下调，，，，，与EMT及心外膜发育有关的上调，，，，，提醒了无MBNL1在损伤后修复中的优势 。。。。（单细胞宏观动态剖析）
为了探讨MBNL1的作用机制，，，，，对连系因子、分解诱导基因以及M基因数据库举行挖掘 。。。。发明Sox9知足条件且是EMT和肌成纤维细胞形成的必需转录因子并举行mRNA衰减实验验证 。。。。（探索机制）
研究内容
对4、14、28天的心梗小鼠肌成纤维细胞举行批量的转录组测序，，，，，发明在梗死修复历程中，，，，，肌成纤维细胞转录组的动态转变与成纤维细胞增殖、肌成纤维和母纤维细胞的相互转变相切合 。。。。在损伤修复历程中，，，，，加入正常成纤维细胞功效的基因下调，，，，，与ECM相关的基因上调，，，，，细胞周期基因先高表达再下降，，，，，提醒了成纤维细胞先增殖又被抑制的情形 。。。。为了较量静止和激活的心脏成纤维细胞之间的基因表达差别，，，，，构建了它莫昔芬诱导的荧光报告转基因小鼠标记激活的成纤维细胞 。。。。FACS疏散两种状态的细胞并检测，，，，，发明MI后postn追踪的激活成纤维细胞中代表性肌成纤维细胞基因（Col1a1、Acta2等）显著上调，，，，，并且MBNL1基因表达在第4天和第14天在激活的肌成纤维细胞中也升高 。。。。证实晰MBNL1活性与损伤后修复的肌成纤维细胞的形成有关 。。。。
为了验证MBNL1过表达是否能将心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，，，，，研究者构建了特异性过表达MBNL1转基因小鼠 。。。。对其心脏成纤维细胞测序剖析，，，，，发明过表达MBNL1的小鼠成纤维细胞中上调的一些转录本是肌成纤维细胞的标记性基因，，，，，与梗死的比照小鼠的成纤维细胞状态相似，，，，，这批注晰MBNL1的过表达能将正常成纤维细胞诱导为心梗后成纤维细胞的类似状态 。。。。虽然状态相似，，，，，但心脏纤维化、aSMA+肌成纤维细胞数目或心脏结构功效方面差别不显着，，，，，研究者推测需要特另外刺激来实现心理性肌成纤维细胞的表型 。。。。随后应用了TGF-β处置惩罚增添aSMA+应力纤维，，，，，并联合SRF处置惩罚增添硬度 。。。。在该历程中发明SRF作用于MBNL1的下游，，，，，敲低SRF会阻断了TGF-β介导的过表达MBNL1心脏成纤维细胞的分解 。。。。
图2.心脏成纤维细胞特异性MBNL1过表达诱导肌成纤维细胞表型
为了建设纤维化表型，，，，，对MBNL1过表达转基因小鼠举行心肌梗死手术发明MI显著上调转基因小鼠心脏成纤维细胞中的几个典范胶原基因 。。。。CLIP-seq效果显示MBNL1定位在胶原和纤维毗连卵白平渗透因子上，，，，，并且在MI一段时间后过表达MBNL1的心脏瘢痕与比照组相比更成熟，，，，，可能是由于Tg心脏成纤维细胞中有关基质成熟因子（Lox和Runx1）的过表达 。。。。通过染色丈量PDGFRa+、EdU+细胞的数目发明，，，，，Tg小鼠成纤维细胞的增殖能力与比照相比显著降低；；RNA-seq剖析显示，，，，，MI后Tg心脏成纤维细胞中阳性细胞周期调控因子均下调，，，，，而细胞周期抑制因子显著上调，，，，，可能是由于过表达MBNL1诱导了细胞凋亡或抑制伤口愈合的增殖限期制了成纤维细胞数目 。。。。这些数据批注，，，，，过表达MBNL1小鼠成纤维细胞增殖镌汰阻止了MBNL1表达和MI损伤对肌成纤维细胞密度和瘢痕天生的叠加效应 。。。。
图3.心肌成纤维细胞中过表达MBNL1可阻止MI依赖性的成纤维细胞增殖
构建MBNL1心脏成纤维特异性敲除小鼠，，，，，以检测MBNL1对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞状态转变的主要性 。。。。正常心脏成纤维细胞特异性MBNL1缺失不影响心脏功效，，，，，但在心肌梗死后，，，，，MBNL1缺失小鼠心室不扩张、缩短功效有所改善且纤维化和肌成纤维细胞密度降低了40%，，，，，批注MBNL1是肌成纤维细胞形成和纤维化所必需的 。。。。Col5a1在MBNL1缺失心脏中显著下调且其ECM中的未成熟胶原纤维较多，，，，，胶原纤维宽度和排列也镌汰，，，，，批注MBNL1缺失导致MI后心脏瘢痕发育不可熟和不稳固 。。。。由于TGF-β处置惩罚能够模拟MI后纤维化形成aSMA+应力纤维，，，，，接纳SRF腺病毒熏染TGF-β处置惩罚的成纤维细胞发明：能够被MBNL1稳固的SRF可以拯救TGF-β介导的肌成纤维细胞分解 。。。。证实晰MBNL1及其下游调控靶点施展作用，，，，，成纤维细胞就能够举行程序化状态转换，，，，，由此说明晰MBNL1在转换中的主要性 。。。。
图4.MBNL1是心脏成纤维细胞状态转变和纤维化瘢痕形成所必需的
EMT调控基因表达的改变并不可确定是由于MBNL1在成纤维细胞转换或心外膜重新激活中的作用 。。。。研究者对正常和MI心脏成纤维细胞举行了单细胞RNA-seq (scRNA-seq)测序，，，，，发明在MBNL1缺失小鼠中，，，，，同时高度表达Sca1和Pdgfra的静止成纤维细胞簇显著增添，，，，，这批注MBNL1缺失的静止成纤维细胞簇此时具备了心脏间充质干细胞的特征 。。。。并且凌驾一半的MBNL1缺失心脏成纤维细胞位于较大的激活肌成纤维细胞簇中，，，，，许多用于连系拼接的转录本均直接连系并受MBNL1调控 。。。。当MI后，，，，，MBNL1缺失将60%的心脏成纤维细胞转化为成熟状态，，，，，说明MBNL1与MI同时作用将静止的成纤维细胞转换为成熟的肌成纤维细胞状态 。。。。心肌梗死后MBNL1功效损失的影响更为显著，，，，，由于整个心脏成纤维细胞群仍处于静止状态，，，，，以是MBNL1关于成纤维细胞的转换起到决议性作用 。。。。
图5.scRNA-seq显示MBNL1在成纤维细胞和肌成纤维细胞之间起着转录后转换的作用
为了评估MBNL1调控的转录本在MI后驱动心脏成纤维细胞状态时的转变，，，，，研究者进一步挖掘了三个数据集：MBNL1连系、肌成纤维细胞分解诱导因子、以及MI后MBNL1缺失心脏成纤维细胞中下调的转录本 。。。。发明Sox9是同时知足三个条件的要害性因子，，，，，它是EMT和肌成纤维细胞形成必需的转录因子 。。。。在MI损伤后，，，，，Sox9在野生型Postn+肌成纤维细胞中的表达增添了8.5倍，，，，，且相关于静止的成纤维细胞，，，，，Sox9的表达仍坚持升高 。。。。相反，，，，，在梗死的MBNL1缺失的心脏中，，，，，Sox9+和PDGFRa+成纤维细胞的百分比降低了2.5倍 。。。。将Sox9转染到心脏成纤维细胞中，，，，，足以在体外诱导成aSMA+肌成纤维细胞，，，，，批注单独Sox9可增进肌成纤维细胞状态，，，，，并可修复MBNL1缺失的成纤维细胞分解缺陷 。。。。已有的研究批注MBNL1连系并调控Sox9，，，，，由于Sox9与MBNL1的表达同时上调，，，，，研究者推测MBNL1可以稳固Sox9的转录 。。。。为了验证这一假设，，，，，对心肌成纤维细胞举行了mRNA衰减检测，，，，，并用腺病毒转染MBNL1 拯救了Sox9的表达，，，，，这个操作减缓了两个基因型介导的衰减率 。。。。这批注心肌梗死后，，，，，MBNL1稳定心脏成纤维细胞中的Sox9转录本，，，，，以增进肌成纤维细胞状态的转变 。。。。
图6.MBNL1稳固Sox9并增进肌成纤维细胞的形成
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