单细胞转录组测序先容
单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing），，，，简朴来说，，，，就是在单个细胞水平上，，，，对转录组水平举行测序剖析的手艺。。。古板测序要领通常在多细胞基础上举行，，，，获得的是一堆细胞中信号的均值，，，，损失了细胞异质性（细胞之间的差别）的信息。。。而单细胞测序手艺能够展现单个细胞的基因表达状态，，，，解决了古板测序无法解决的细胞异质性问题。。。
这项手艺自2009年首次问世以来，，，，一连一直地生长。。。近年来，，，，单细胞测序履历了爆发式的生长和普及。。。它在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域施展着主要作用，，，，成为生命科学研究的焦点。。。单细胞转录组测序手艺的一直生长将在精准治疗、生物医学研究和临床应用中施展越来越主要的作用。。。单细胞测序手艺正在推动生物学领域向宿世长，，，，为个性化预防和治疗提供了手艺支持。。。
肿瘤研究：单细胞测序手艺资助展现肿瘤内差别细胞类型的异质性，，，，探索肿瘤微情形中细胞的转录组表达和免疫功效。。。
发育生物学：通过单细胞测序，，，，我们可以追踪胚胎发育历程中差别细胞的基因表达转变，，，，明确细胞分解和发育。。。
神经科学：研究单个神经元的转录组可以资助我们明确神经系统的功效、神经退行性疾病以及神经元之间的相互作用。。。
免疫学：单细胞测序手艺有助于研究免疫细胞的异质性，，，，例如T细胞、B细胞和巨噬细胞的功效状态。。。
微生物学：通过单细胞测序，，，，我们可以深入相识微生物群落中差别细菌、病毒和其他微生物的基因表达。。。
10x 3’单细胞
使用10x Genomics Chromium微流控系统，，，，实现通过序列标签区别差别细胞和转录本。。。微流控系统通道直径很小一次通过一个细胞。。。首先在通道中加入带有标签的凝胶微珠，，，，单个细胞和单个带有标签的凝胶微珠连系，，，，二者被加入的油包裹到一个液滴中，，，，形成油包水系统。。。凝胶微珠上带有大宗包括凝胶微珠特异性Barcode序列、分子特异性UMI序列和polyT序列的引物序列，，，，将细胞裂解后mRNA分子被引物序列中的polyT捕获，，，，扩增后形成携带有Barcode和UMI序列的cDNA，，，，即可实现将差别细胞泉源的差别mRNA分子加上标签。。。
Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，，，，每个微珠外貌携带有几十万个Oligo序列（如下图）。。。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；；；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带差别的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；；；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序枚举行绝对定量，，，，阻止扩增爆发偏好；；；第四段是30bp的ployT，，，，用于捕获有ployA尾的转录本。。。
对制备好的单细胞悬液先举行质检，，，，质检及格后与Gel Beads和油划分加入到Chromium Chip G的差别通道，，，，经由微流体“T字”交织系统形成GEM。。。接着细胞裂解，，，，Gel Beads自动溶诠释放大宗引物序列，，，，与带有PolyA的mRNA举行逆转录，，，，天生带有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一链。。。
样本起始量与送样建议
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组织类型 |
新鲜组织、新鲜悬液或速冻组织 |
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细胞巨细 |
＜40 μm |
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细胞活性 |
>85%（只管去除细胞团/碎片/杂质等） |
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细胞浓度 |
700~1200 cells/μL |
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细胞总量 |
＞5万 |
注重事项：详细样本准备指南，，，，请联系在线客服。。。
生物信息学剖析内容
代表性文章
【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：单细胞剖析显示肝癌干细胞的异质性
论文问题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
揭晓杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，，，，手术切除肿瘤样本P1
手艺手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选
研究配景
肝细胞癌（HCC，，，，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，，，，hepatic cancer stem cells）的保存。。。 由种种细胞外貌标记物界说的差别CSC群体可能包括差别的致癌驱动因素，，，，这在界说靶向疗法时组成了挑战。。。 研究职员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功效剖析用以评估CSC的异质性水平。。。效果批注，，，，CSC在单细胞水平上的表型、功效和转录均保存异质性性，，，，差别的CSC亚群具有差别的分子特征。。。并且有趣的是，，，，差别CSC亚群内的差别基因与HCC预后相关，，，，并且相相互互自力，，，，批注CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤希望。。。
文章效果
大宗数据批注CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等外貌标记物可以界说CSC，，，，研究职员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7差别细胞亚群，，，，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。。。免疫荧光染色批注，，，，在两种细胞作育形态下（单层作育、球体作育）,两个HCC细胞系均体现出显着的细胞异质性。。。
HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数划分是1343、1134）正常作育和缺氧作育（增进细胞干性）2周后，，，，研究职员遵照三种外貌标记物（CD24、CD133、EpCAM）分选细胞，，，，HuH1和HuH7中标记物阳性的CSCs比例划分为15-20%、8-12%，，，，而标记物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B），，，，作育后差别细胞亚群的自我更新能力差别很大（下图C-D）；；； 分选后的细胞经由1个月作育后，，，，和未分的得细胞相比，，，，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+细胞能够扩大成为混淆CSCs，，，，而存活下的Triple-细胞能够扩大成混淆CSCs，，，，可能是由于部分细胞不是真正的标记阴性细胞，，，，或者标记阴性细胞履历了转换变为标记阳性细胞（下图E）。。。
研究职员接纳SMART-Seq方法剖析HuH1和HuH7阳性标记细胞以及分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-细胞）细胞表达谱（单个细胞测序、10细胞混淆测序、100细胞混淆测序）信息，，，，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表达谱数据做了较量，，，，发明差别细胞类群具有差别的基因表达模式，，，，且差别类型细胞中每个细胞的基因表达模式均保存差别，，，，HuH7细胞间差别大于HuH1；；；当细胞混淆（10细胞混淆、100细胞混淆）后这种差别水平显着降低（下图A）。。。而当单独聚类HuH7细胞时，，，，发明差别标记细胞相互可以区分（下图B）。。。以上数据均批注单细胞水平上转录组保存异质性。。。
研究职员较量了HuH7阳性标记细胞（Triple+）和阴性标记细胞（Triple-）基因表达差别，，，，判断到的286个Triple+相关基因可以展望来自LCI行列的240例肿瘤样本、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生涯率，，，，但在非肿瘤样本中无意义。。。
差别标记CSC细胞群体基因表达较量剖析，，，，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特征基因基本不重合（下图A），，，，IPA通路剖析也批注差别细胞群体的通路也不重合（下图C-F），，，，并且差别细胞群体特征基因可以用于生涯期展望，，，，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有优势（下图B）。。。
为了整体相识细胞群体多样性，，，，研究职员接纳10X 单细胞测序方法，，，，对3847个HuH1、HuH7、P1细胞举行了剖析，，，， HuH1可以分为2个亚群，，，，HuH7分为4个细胞亚群，，，，P1分为3个细胞亚群，，，，细胞聚类效果与与SMART-seq效果类似（下图A）。。。CSC标记物，，，，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因，，，，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（下图C）在差别细胞亚群中表达保存异质性。。。P1的3个细胞亚群中表达了山中因子 (KLF4、POU5F1、MYC)，，，， 干细胞marker (NANOG)，，，，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，，，，但其表达也保存异质性，，，，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（划分表达T细胞marker和B细胞marker），，，，第三个P1亚群主要为HCC细胞（下图D）。。。
参考文献
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
效果展示
1. 单细胞亚群分类
针对PCA效果中选取前10个主因素，，，，接纳graph-based聚类要领对细胞举行分类。。。使用相同的数据举行t-SNE剖析，，，，然后将聚类效果在t-SNE映射中展示。。。
2. Marker基因剖析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图
3. 差别基因KEGG富集性剖析
Pathway通路图展收说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差别表达转录本，，，，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差别表达转录本，，，，橘黄色代表注释到某个ko节点不但有上调又有下调的显著差别表达转录本。。。方框内的4位数字体现种种酶的EC编号；；；空心圆圈体现小分子化合物；；；实心箭头体现生化反应的偏向；；；虚线箭头毗连其他的相关代谢途径。。。下图仅为报告中的展示图片
常见问题（FAQ）
1、单细胞转录组测序需要做重复吗？？？ ？？？
单细胞测序的目的在于判断细胞群体中的差别亚群、获得新的主要分子标记物和判断有数细胞亚群等，，，，因此更多的是关注细胞和细胞之间的差别。。。从现在已有的文献看，，，，对重复数没有强制要求。。。但从近期的发文趋势来看，，，，建议每组设置样本数3~5 个，，，，临床样本凭证现真相形建议每组 5 例以上。。。
2、组织样本怎样制备单细胞悬液？？？ ？？？
单细胞转录组测序现在没有一个统一的样本制备要领，，，，针关于差别的组织样本，，，，有差别类型的样本单细胞制备要领。。。别的，，，，可以详细凭证先生提供的详细样本类型，，，，查阅相关的文献，，，，探讨适合于先生样本的单细胞悬液制备要领。。。
3、单细胞转录组每个细胞能捕获到几多个基因？？？ ？？？
凭证差别的细胞类型，，，，捕获到的基因数会有区别，，，，有些细胞类型高的会在3000左右，，，，而有些或许在1000左右。。�；；；蚣斐鍪胙咀刺泄�，，，，差别类型的样本，，，，基因检出数可能保存数倍的差别。。。
SeekOneDD 3’单细胞
SeekOneDD (Digital Droplet) 单细胞3’转录组测序接纳SeekOneMM单细胞转录组试剂盒举行单细胞转录组建库，，，，通过微孔芯片(SeekOneChip)和核酸标记磁珠(Barcoded Beads)即可实现单细胞的捕获、标记。。。最终构建出兼容Illumina 测序仪的高通量单细胞转录组文库举行测序，，，，随后举行一系列生信剖析。。。
SeekOneDD系统基于微流控手艺原理，，，，通过油包水实现单细胞疏散捕获，，，，使用凝胶微珠上Barcoded Beads对差别细胞举行标记，，，，通过UMI的标签对mRNA举行定量，，，，来构建高通量单细胞文库，，，，数据下机后使用SeekOne Tools完成单细胞数据质控处置惩罚。。。
BD 3’单细胞
BD Rhapsody的手艺不再接纳使用微流控孔道射出细胞和射出的磁珠碰撞举行单细胞捕获，，，，而是接纳CytoSeq特有的蜂窝板手艺。。。该手艺用20W+的微孔（远大于Input细胞数目），，，，包管单孔中的单细胞捕获。。。在细胞捕获完成后，，，，举行细胞裂解，，，，细胞释放出的mRNA可以被polydT的beads在微孔中捕获。。。
BD Rhapsody Beads
由以下3部分组成：
1. CL（细胞标签,cell label）：一个磁珠上的CL序列相同，，，，差别磁珠上的CL序列差别，，，，从而抵达区分细胞的作用；；；
2. UMI（unique molecular identifier）：一个磁珠上的引物UMI各不相同，，，，用于区分差别的mRNA分子，，，，阻止PCR偏好性；；；
3. ploy dT：与mRNA 3‘端poly A互补配对，，，，以捕获polyA尾的mRNA；；；
BD Rhapsody是使用铺满20万个直径50 μm微孔的微孔板和携带细胞标签（cell label）的直径35 μm磁性beads捕获细胞。。。将制备好的单细胞悬液铺至微孔板上，，，，细胞靠自身重力沉降至微孔底部，，，，沉降速率慢的死细胞和杂质在这一步会被冲洗掉；；；控制细胞数目，，，，镌汰两个细胞落入一个微孔的征象（形成doublets）；；；接着将beads铺至微孔板，，，，同样沉降至微孔板底部；；；冲洗掉多余的beads并加入细胞裂解液，，，，细胞释放出的mRNA可以被polydT的beads在微孔中捕获。。。使用磁铁接纳beads到单管中举行后续逆转录、建库等操作。。。
10x 5’单细胞及免疫组库
10x V(D)J 接纳TCR/BCR恒定区的一连巢式引物对全长cDNA举行扩增，，，，以获取个体中所有T/B细胞的BCR和TCR的V(D)J全长序列总和。。。在肿瘤微情形、熏染性疾病、器官移植后倾轧、免疫治疗等研究领域中有着普遍的应用。。。
手艺优势
可实现成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序
细腻到单细胞水平，，，，能获得大宗单细胞的免疫组库数据
大规模单细胞VDJ+表达谱测序，，，，单个细胞本钱大大降低
代表性文章
ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060
案例展示
单细胞测序展现重大的肿瘤微情形
研究配景
相识肿瘤微情形中的免疫细胞表型，，，，对相识癌症希望和免疫疗法的机制是必不可少的。。。本研究从8名乳腺癌患者的肿瘤样本及配对的正常血液、乳腺和淋投合样本中获得多个免疫细胞，，，，开展单细胞RNA测序实验。。。之后，，，，使用SEQC流程和“Biscuit”算法，，，，对这些组织中的免疫细胞举行聚类和判断。。。
研究思绪
本研究总共判断出83个差别的免疫细胞簇，，，，包括38个T细胞簇、27个骨髓谱系细胞簇、9个B细胞簇和9个自然杀伤细胞簇。。。大大都的细胞簇（除了其中的10个）是不止一名患者所共有的，，，，只管在肿瘤样本中的表型往往差别。。。研究指出，，，，部分T细胞在肿瘤和正常组织中都保存，，，，不过细胞毒性T细胞在肿瘤中更富厚，，，，Treg细胞也是云云。。。
在一系列后续实验中，，，，研究职员使用10X Genomics的要领获得27,000多个T细胞的TCR-seq和RNA-seq配对数据并开展剖析。。。较量了正常组织和乳腺癌组织的免疫组库，，，，发明表型扩增往往爆发在乳腺癌微情形中。。。
这些视察效果，，，，以及免疫细胞的RNA-seq和TCR-seq数据集和周全的剖析平台，，，，将有助于研究职员更好地相识免疫细胞增进和延缓肿瘤生长背后的分子机制。。。
参考文献
ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060
效果展示
1.V-J paired特征剖析
V-J paired直接反应出CDR3或免疫组库的转变，，，，图中横坐标为V Gene，，，，纵坐标为J Gene。。。颜色越深体现V-J paired品貌越高。。。
2.V/J基因特征剖析
对CDR3 V/J基因序列长度漫衍情形举行统计，，，，图中横坐标为CDR3(V Gene)碱基序列长度，，，，纵坐标为对应的clonotype name频率，，，，差别颜色体现差别V Gene，，，，top10的V Gene用彩色体现，，，，other（灰色部分）体现其他V Gene。。。
3.Clonotype分型
一个clonotype（克隆亚型）的界说为：一组唯一的CDR3核苷酸序列。。。Cell Ranger凭证拼接获得的Consensus中的CDR3氨基酸序枚举行Clonotype分型，，，，其有用Barcode为该Clonotype的品貌。。。使用圈图展示免疫组库的top10 clonotype频率漫衍（clonality）。。。
10x 单细胞ATAC-seq
ATAC-seq（Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，，，，染色质易开放区域测序）是2013年由美国Stanford大学的William Greenleaf教授研发了一种全新的要领，，，，使用DNA转座酶连系高通量测序手艺，，，，来研究染色体的可进入性。。。ATAC-seq的原理是，，，，染色质易开放区域测序）使用Tn5转座酶切割染色质的开放区域，，，，并加上测序引物举行高通量测序，，，，通过生物信息剖析判断转录因子连系位点和核小体区域位置，，，，从而为研究基因调控、DNA 印记等提供有用的要领。。。通过研究特定状态下开放染色质，，，，可以在DNA水平研究基因转录调控。。。
古板的寻找全基因组规模内开放的染色质区域接纳的方法包括ATAC-seq、MNase-seq和DNase-seq，，，，FAIRE-seq、chip-seq等。。。10x Genomics Chromium Single Cell ATAC Solution（10X scATAC-seq）是10 X Genomics新推出单细胞表观基因组学水平上展现染色质可靠近性的研究战略。。。通过单细胞染色质可靠近性图谱构建，，，，不但能清晰相识染色质结构，，，，还可以绘制高区分率转录因子调控网络，，，，为深入相识疾病的诊断和治疗铺平蹊径。。。
手艺优势
可检测单细胞转录调控区域中的开放染色质
每个通道可容纳500-10000个细胞核
细胞核捕获率高达65%
运用10x官方软件和工具，，，，可对单细胞基因调控网络举行细腻化剖析
代表性文章
Buenrostro J D , Corces M R , Lareau C A . Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.[J]. Cell, 2018.
案例展示
联合差别单细胞剖析手艺绘制人类造血系统分解的一连调理谱
研究配景
造血分解 是从造血干细胞分解为具有差别功效的细胞历程，，，，在成人中主要爆发在骨髓，，，，最终爆发淋巴系细胞（B,T,NK cell）,髓系-粒系（monocyte, granulocyte），，，，红系（Ery,mega）等细胞类型，，，，是研究干细胞分解、肿瘤免疫、血液疾病等的优异模子。。。造血分解历程是一个重大、多阶段的，，，，受多种因子调控的历程，，，，单细胞表观基因组剖析有助于剖析造血干细胞转录和细胞运气异质性的顺式和反式调理机制。。。
研究思绪
首先使用scATAC-seq数据从chromatin accessibility入手，，，，剖析造血分解历程染色质开放状态图谱的异质性；；；用ChromVAR R包展望TF的运动；；；接纳多种聚类要领，，，，如通过TF Z scores使用Hierarchical clustering 和t-SNE聚类，，，，并接纳了reference guided approach，，，，基于bulk sample和算法对单细胞数据举行降维聚类剖析；；；整合scRNA-seq 和scATAC-seq数据剖析TF与chromatin accessibility，，，，以及顺式调控元件和相近基因的表达的相互关系。。。
研究效果
研究职员通过单细胞ATAC-Seq的研究战略，，，，剖析了10类已界说的人类造血系统分解细胞类型中染色质可靠近性的数据，，，，构制作血细胞分解中染色质可靠近性状态的转变轨迹；；；并整合单细胞转录组数据，，，，构建了转录因子动态调控轨迹。。。
从单细胞RNA-seq和ATAC-seq的整合剖析提供了对人类造血功效的调理特征和动态的看法，，，，在实验或盘算上整合多种单细胞数据类型的进一步刷新将为发育或疾病细胞运气决议提供单细胞水平上的视角。。。期望未来的事情连系单细胞表观基因组学、转录组学、卵白质组学和谱系丈量可以展现对启动调理多种细胞运气转换的调理因子的分子机制和时间顺序的主要看法。。。
参考文献
Buenrostro J D , Corces M R , Lareau C A . Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.[J]. Cell, 2018.
效果展示
1. 细胞聚类
Cell Ranger ATAC 使用每个细胞的peaks 信息，，，，运行cluster mode 对这些细胞举行分群。。。经tSNE 降维算法，，，，获得细胞聚类的二维效果。。。
2. 数据可视化
10X genomics公司提供的专门的剖析效果审查软件-Loupe Cell Browser，，，，该软件是一个图形界面的软件，，，，操作很是的利便。。。�？？ ？？？梢杂糜谝韵掠τ茫�1.确定细胞类型: 使用可及性模式发明能够区分差别细胞类型和功效组别的启动子和转录因子motif；；；2.剖析可及性差别: 使用ATAC Peak Viewer 定位具有假定调理功效的差别可会见基因组区域的位置；；；3.发明显著性特征: 建设自界说聚类并使用差别可及性剖析工具精准识别数据中的细胞组别；；；4.共享数据效果: 生涯感兴趣的信息，，，，导出数据表，，，，并获取单细胞ATAC数据的屏幕截图。。。
