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行业快讯

JCI重磅！膀胱癌淋巴转移了？？原来是外泌体lncRNA在搞破损

时间：2020-10-29 热度：

   膀胱癌（BCa）作为全球最常见的恶性肿瘤之一，，是男性癌症相关殒命的主要缘故原由，，2018年预计新增55万病例和2万人殒命。。。BCa患者的预后与淋投合（LN）转移亲近相关，，其5年生涯率从77.6%下降到18.6%，，可是BCa中引发淋投合转移的分子机制仍不清晰。。。
   研究报道由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）爆发的VEGF-C在BCa淋巴管天生和淋投合转移中起主要作用。。。别的，，PROX1对淋巴管系统的形成、调理内皮细胞的分解和诱导淋巴管内皮细胞的淋巴出芽和延伸也起到要害作用。。。然而，，癌细胞增进淋巴管天生和PROX1上调简直切机制仍需要进一步探讨。。。
   外泌体是一类粒径巨细为30-150nm的细小囊泡，，内容物含有种种核酸组分，，包括mRNAs、miRNAs、lncRNAs。。。最近有研究批注癌症细胞渗透的外泌体是细胞间通讯的要害信使，，与癌症引起的血管通透性、炎症等相关。。。
克日，，中山大学孙逸仙纪念医院的林天歆课题组报道了一种lncRNA，，LINC00858，，被称为淋投合转移相关转录物2（LNMAT2），，在BCa组织中过表达，，同时也在BCa患者的尿液外泌体（urinary-EXO）中大宗富集，，且与淋投合转移呈正相关。。。外泌体LNMAT2能在体内外增进淋巴管天生和LN转移。。�；；；；粕希�，装载到外泌体中的LNMAT2与异质核糖核卵白A2B1（hnRNPA2B1）直接相互作用，，并被转达到人淋巴管内皮细胞（HLECs）。。。随后，，LNMAT2通过诱导hnRNPA2B1介导的H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）与PROX1启动子形成三聚体，，增强PROX1转录，，从而BCa中增进淋巴管天生和LN转移。。。
   UG环球生物可提供从实验设计、外泌体疏散、外泌体判断、外泌体高通量检测、外泌体示踪到体内外功效验证的整体效劳。。。

实验效果：

1.LNMAT2过表达与BCa淋投合转移相关
作者通过二代测序（NGS）手艺划分测差别组织中的lncRNAs表达情形，，即5例BCa患者中高度肌肉侵袭性膀胱癌（MIBC组织）和癌旁组织（NATs），，5对LN阳性和LN阴性的BCa组织。。。数据剖析显示，，与NATs相比，，LNMAT2在MIBC组织中表达增添了3倍以上；；；；与LN阴性组织相比，，LN阳性组织中LNMAT2表达也提高了3倍以上。。。随后作者用266个BCa患者的膀胱癌组织和癌旁组织举行实时定量PCR（qRT-PCR），，效果进一步证实了LNMAT2在膀胱癌组中泛起过表达征象。。。随后，，通过RACE、FISH等实验对LNMAT2的特征举行叙述，，LNMAT2位于染色体10q23.1，，全长为3187nt，，定位于BCa细胞的胞质中。。。
别的，，作者通过对266个BCa患者的检测数据剖析，，发明BCa患者的LNMAT2表达与LN转移呈正相关（Figure 1A）。。。Kaplan-Meier曲线剖析展现了LNMAT2过表达会使BCa患者有较短的总生涯期(OS)和无病生涯率（DFS）（Figure 1B-C）。。。原位杂交（ISH）效果批注LNMAT2在LN阳性的BCa组织中显著上调，，在LN阴性的BCa组织中有稍许增添，，在NATs中险些检测不出（Figure 1D-E）。。。主要的是，，LNMAT2表达也与淋巴管密度呈正相关，，可以用淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）举行视察，，可是BCa中没有看到LNMAT2和VEGF-C表达之间的相关性（Figure 1F-H）。。。

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Figure 1 LNMAT2过表达与BCa淋巴转移有相关性

2.LNMAT2在BCa细胞渗透的外泌体中富集
由于胞外lncRNAs主要包裹在特定的亚细胞结构中，，尤其是外泌体，，且在介导细胞间相互作用和增进肿瘤淋投合转移方面具有主要的生物学功效，，故作者检测了BCa细胞渗透的外泌体中LNMAT2表达水平。。。作者用qRT-PCR剖析了206例BCa患者和120例康健比照者的尿液样本中疏散的外泌体，，发明与康健比照组相比，，从BCa患者获得的尿液EXO中LNMAT2水平上调(Figure 2A),这批注晰外泌体LNMAT2对BCa的生长至关主要。。。
随后作者进一步检测了从BCa细胞系(5637和UM-UC-3)的作育上清中疏散的外泌体中LNMAT2的表达。。。为了证实从作育上清中疏散获得的颗粒是外泌体，，作者划分用透射电镜（TEM）判断外泌体的杯状形态（Figure 2B）、Nanosight剖析外泌体的大�。。。‵igure 2C）和WB检测外泌体的特定标记物（CD9和CD63）（Figure 2D）。。。在5637和UM-UC-3细胞系中LNMAT2表达显著上调，，同时LNMAT2在BCa细胞渗透的外泌体中富集量与细胞表达量相关，，这展现了LNMAT2主要以外泌体形式施展其作用（Figure 2E）。。。过表达或滋扰细胞中LNMAT2的表达同时会响应地上调或下调外泌体中LNMAT2的表达（Figure 2，，H和I）。。。总之，，上述效果批注晰LNMAT2在BCa细胞渗透的外泌体中大宗富集。。。

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Figure 2 LNMAT2水平在BCa细胞渗透的外泌体中显示上调

3.BCa细胞渗透的外泌体LNMAT2可在体外增进淋巴管天生
作者将BCa细胞渗透的外泌体与HLECs细胞共孵育，，检测发明与比照组相比，，BCa细胞渗透的外泌体能显著增进HLEC的成管和迁徙能力（Figure3，，A-C）。。。由过表达LNMAT2细胞渗透的外泌体能强烈诱导HLEC的成管和迁徙（Figure 3，，D-F），，而由滋扰LNMAT2细胞渗透的外泌体失去了其诱导HLEC的成管和迁徙的能力（Figure 3，，G-I）。。。

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Figure 3 外泌体LNMAT2能在体外增进淋巴管天生

4.外泌体LNMAT2能在体内增进淋巴转移
作者将luciferase标记的UM-UC-3细胞移植到裸鼠的脚垫处，，并把裸鼠随机分成3组，，随后举行瘤内注射，，3组注射剂划分为PBS（control）、转染了空载体的UM-UC-3细胞渗透的外泌体（UM-UC-3-EXOvector）、转染了带有LNMAT2的UM-UC-3细胞渗透的外泌体（UM-UC-3-EXOLNMAT2）。。。当原发肿瘤抵达200mm3，，切除肿瘤和腘窝淋投合举行剖析（Figure 4A）。。。效果发明，，与比照组或UM-UC-3-EXOvector相比，，UM-UC-3-EXOLNMAT2能显著提高BCa细胞向LNs转移的能力（Figure 4，，B和C）。。。UM-UC-3-EXOLNMAT2组中腘窝淋投合的体积也比比照组或UM-UC-3-EXOvector大（Figure 4，，D和E）。。。萤光素酶免疫染色实验也批注晰UM-UC-3-EXOLNMAT2组中外泌体的LNMAT2能提高BCa细胞向LNs转移的能力（Figure 4，，F和G）。。。

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Figure 4 外泌体LNMAT2能在体内增进淋投合转移

随后，，作者研究了外泌体LNMAT2的体内致瘤能力，，即小鼠皮下接种UM-UC-3细胞，，并将小鼠随机分为3组，，再向每组划分瘤内注射PBS、UM-UC-3-EXOvector和UM-UC-3-EXOLNMAT2，，每3天注射一次，，一连5周（Figure 5A）。。。效果发明，，与UM-UC-3-EXOvector组和PBS组相比，，UM-UC-3-EXOLNMAT2增进了肿瘤的生长（Figure 5，，B-D），，体现在肿瘤的巨细、重量及增殖marker Ki67的检测上（Figure 5，，E-H）。。。上述数据展现了BCa细胞渗透的外泌体LNMAT2能在体内增进淋巴管天生和LN转移。。。

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Figure 5 外泌体LNMAT2能在体内增进BCa淋巴管天生

5.LNMAT2与hnRNPA2B1直接相互作用
作者用RNA pull-down实验获得了一个显着的35-40kDa条带（Figure 6A），，经质谱（MS）证实是hnRNPA2B1（Figure 6B），，通过WB检测也说明晰LNMAT2特异地与hnRNPA2B1连系（Figure 6，，C和D）。。。别的，，LNMAT2FISH和hnRNPA2B1免疫染色实验效果显示了LNMAT2和hnRNPA2B1主要集中在BCa细胞的胞质中（Figure 6E）。。。RNA免疫沉淀（RIP）效果验证了LNMAT2和hnRNPA2B1之间的相互作用（Figure 6F）。。。随后通过序列剖析进一步寻找到LNMAT2和hnRNPA2B1相互作用的区域（Figure 6K）。。。

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Figure 6 LNMAT2与hnRNPA2B1直接相互作用

6.hnRNPA2B1介导LNMAT2包装进外泌体
   作者想验证LNMAT2与hnRNPA2B1之间的相互作用是否能增进LNMAT2包装进外泌体，，于是，，作者将hnRNPA2B1敲低，，发明BCa细胞渗透的外泌体LNMAT2水平降低，，而BCa细胞中LNMAT2水平没有转变。。。随后，，通过突变LNMAT2与hnRNPA2B1之间的连系位点，，证实晰hnRNPA2B1与这些连系位点之间的相互作用关于LNMAT2包装成外泌体很主要（Figure 7B）。。。别的，，与miR-18a相比，，这是一种只在细胞中保存，，而外泌体中没有的miRNA，，LNMAT2泛起了较高的外泌体-细胞的比率（Figure 7C）。。。hnRNPA2B1敲低后显著降低了BCa细胞渗透的外泌体中LNMAT2和miR-98富集水平（Figure 7D），，这批注晰LNMAT2以hnRNPA2B1依赖的方法特异性地包装进外泌体。。。
7.外泌体LNMAT2能被HLECs吸收并诱导其淋巴管天生
   作者将纯化的外泌体举行PKH67绿色荧光标记，，并与HLECs孵育12h。。。共聚焦图片显示受体细胞HLECs胞质中有绿色荧光信号，，而比照组中没有视察到PKH67荧光信号（Figure 7E）。。。别的，，作者发明HLECs与外泌体共孵育后，，其LNMAT2表达显著提高（Figure 7F）。。。
   作者用CRISPR/Cas9要领敲除了HLECs中LNMAT2，，建设了LNMAT2-KO细胞系，，再举行LNMAT2缺失检测，，批注内源性LNMAT2表达乐成被抑制（Figure 7H）。。。随后再考察外泌体LNMAT2对LNMAT2-WT和LNMAT2-KO细胞的影响，，通过成管和Transwell实验发明，，与转染了滋扰比照组（si-NC）5637细胞渗透的外泌体(5637-EXOsi-NC)相比，，转染了si-LNMAT2#1的5637细胞渗透的外泌体能降低LNMAT2-KO HLEC的增殖和迁徙（Figure 7，，I-K）。。。上述这些效果批注，，BCa细胞通过向HLECs转达外泌体LNMAT2来诱导淋巴管天生。。。

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Figure 7LNMAT2以hnRNPA2B1依赖的方法包装入外泌体中并转达到HLECs

8.外泌体LNMAT2自力于VEGF-C上调PROX1表达
   之前的文献报道了肿瘤细胞和TAMs爆发的VEGF-C有助于BCa中淋巴管天生和LN转移，，然而，，20%以上伴有淋投合转移的BCa呈低VEGF-C表达。。。作者的研究效果显示，，无论是LNMAT2过表达照旧LNMAT2敲低，，5637和UM-UC-3细胞中VEGF-C的mRNA或卵白水平基本都没有改变，，这也说明晰BCa中LNMAT2诱导的淋巴管天生和LN转移可能通过一种自力于VEGF-C的机制而爆发的。。。
   有研究报道，，PROX1通过调理内皮细胞分解和转移，，对淋巴管系统的发育较量主要。。。有趣的是，，与比照组相比，，用外泌体LNMAT2处置惩罚HLECs，，其PROX1表达显著提高（Figure 8，，A和B），，批注在HLECs中外泌体LNMAT2能上调PROX1表达。。。
9.外泌体LNMAT2能与PROX1启动子形成DNA-RNA三聚体
   作者研究发明，，外泌体LNMAT2大宗富集到HLECs的细胞核中，，随后通过萤光素酶和CHIRP实验证实晰外泌体LNMAT2与HLECs中PROX1启动子的P3（-607bp至-597bp）区域相互作用（Figure 8，，C-F）。。。
   为了进一步研究LNMAT2是否直接与PROX1启动子相互作用，，作者使用LongTarget工具获得了5对潜在的三聚体形式的寡核苷酸（TFOs）和它们对应的三聚体目的位点（TTSs），，并且每个连系位置可以用荧光共振能量转移（FRET）剖析和圆二色性（CD）光谱检测。。。经由多个实验验证，，说明晰外泌体LNMAT可通过与hnRNPA2B1直接作用以增强PROX1启动子的H3K4me3水平，，从而上调PROX1表达（Figure 8）。。。

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Figure 8外泌体LNMAT2与PROX1启动子形成一种DNA-RNA三聚体

10.外泌体LNMAT2与hnRNPA2B1相互作用，，以增进PROX1启动子处的H3K4三甲基化
作者探讨了HLECs中hnRNPA2B1是否通过调理PROX1启动子区域的H3K4me3水平而加入外泌体LNMAT2诱导的PROX1转录激活。。。用5637-EXOLNMAT2、UM-UC-3-EXOLNMAT2和5637-EXOsi-LNMAT2#1划分处置惩罚HLECs，，连系CHIP实验，，发明外泌体LNMAT能与hnRNPA2B1直接相互作用并增添PROX1启动子区H3K4me3水平，，从而上调PROX1表达水平。。。
11.外泌体LNMAT2诱扶引起PROX1上调增进淋巴转移
接下来，，作者镌汰外泌体中LNMAT2表达，，会使肿瘤诱导的HLEC增殖、迁徙功效随之降低（Figure 9，，A-C）。。。而滋扰PROX1会显著消除外泌体LNMAT2引起的HLEC成管和迁徙征象，，并且是自力于VEGF-C的方法，，因此，，PROX1关于体外外泌体LNMAT2介导的自力于VEGF-C而引起淋巴管天生和淋投合转移是必需的。。。别的，，体内实验批注，，经由VEGF-C中和抗体处置惩罚后，，与UM-UC-3-EXOvector组相比，，UM-UC-3-EXOLNMAT2组腘窝LNs体积更大（Figure 9，，D-F）。。。小鼠BCa组织的IHC效果也说明晰LNMAT2高水平时，，肿瘤内和肿瘤周围区域的LYVE-1阳性淋巴管中PROX1表达均升高（Figure 9，，G-I）。。。这些数据进一步证实，，外泌体LNMAT2上调PROX1表达，，以VEGF-C无关的方法诱导BCa淋巴转移。。。

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Figure 9PROX1是外泌体LNMAT2介导的淋巴管天生所必需的

12.外泌体LNMAT2与BCa患者的淋投合转移有关
作者发明在另外206例患者的检测中，，LNMAT2过表达与BCa组织瘤内和瘤周围区域淋巴管密度增添有关（Figure 10，，A和B）。。。ISH效果显示，，当BCa患者中外泌体LNMAT2高表达时，，肿瘤组织中LNMAT2水平也会显著升高，，这批注外泌体LNMAT2在与LNMAT2相关的BCa淋投合转移中起主要作用。。。随后，，作者考察外泌体LNMAT2是否与BCa淋投合转移相关。。。有淋投合转移的BCa患者的外泌体LNMAT2表达显着高于无淋投合转移的BCa患者（Figure 10C）。。。别的，，Kaplan-Meier剖析显示外泌体LNMAT2表达水平高与BCa的不良预后有关（Figure 10，，D和E）。。。受试者事情特征曲线（ROC）剖析显示，，尿液中的外泌体LNMAT2可区分BCa患者于康健比照组，，且AUC曲线关于BCa淋投合转移的准确性判断更高（Figure 10，，F和G）。。。同时，，作者也检测了血清中外泌体LNMAT2水平，，也发明LN转移的BCa患者血清中外泌体LNMAT2表达显著提高。。。综上所述，，作者的效果批注，，外泌体LNMAT2可能是BCa患者LN转移的一个潜在诊断标记物和治疗靶点（Figure 10H）。。。

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Figure 10外泌体LNMAT2与BCa患者的淋投合转移有关

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结论：
在本篇文章，，作者发明了BCa中外泌体lncRNA介导了一个与VEF-C无关的LN转移机制，，并且判断LNMAT2可以作为BCa淋巴转移的一个治疗靶点。。。

参考文献：
J Clin Invest.2020 Jan 2;130(1):404-421. Exosomal long noncoding RNA LNMAT2 promotes lymphatic metastasis in bladder cancer.

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