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行业快讯

【Nature Neuroscience】抑癌基因体内功效筛选新步伐：AAV CRISPR突变库！

时间：2017-08-17 热度：

胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme）是脑癌中殒命率最高和最常见的一种，，，，是除脑干胶质瘤外预后情形最不乐观的中枢神经系统癌症。 。。。

雪上加霜的是，，，，现在的所有治疗手段都无法治愈胶质母细胞瘤患者，，，，患者的中位生涯期仅有12.2-18.2个月。 。。。因此，，，，全天下的科学家、医生都在起劲检测和治疗这种恶性疾病。 。。。
在基因检测层面，，，，人们对胶质母细胞瘤患者举行的基因图谱剖析发明了223个基因中的453个突变位点，，，，并最终找出71个显著突变基因（SMGs）。 。。。然而，，，，大宗新发明的基因功效从未被解读，，，，特殊是这些基因在胶质母细胞瘤中的作用尚不清晰。 。。。

而由于差别患者个体中的基因突变组合差别，，，，我们难以诠释重大的突变与疾病的因果关系，，，，也造成胶质母细胞瘤患者病程的差别化及抗药性的差别。 。。。
因此，，，，我们需要对胶质母细胞瘤举行深入的基因功效剖析和表型定量测定，，，，这关于治疗该疾病至关主要。 。。。可是，，，，现在没有任何一项研究能够给出结论，，，，说明在患者中发明的某些突变基因能够驱动正常细胞转化为胶质母细胞瘤。 。。。

本周一，，，，来自耶鲁大学医学院的华人科学家Sidi Chen与瑞士巴塞尔的Randall J Platt教授，，，，以及CRISPR领域大牛张锋教授相助，，，，在Nature Neuroscience揭晓了最新事情[1]。 。。。他们借助AAV病毒载体介导的在体CRISPR扫描手艺，，，，在完全免疫活性的小鼠脑中，，，，使用获取测序手段读取突变数据和转录组剖析等多手艺，，，，乐成地筛选了一系列导致脑胶质母细胞瘤爆发的要害基因突变。 。。。

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实验效果与结论：

1. 脑定位注射AAV-CRISPR库诱导胶质母细胞瘤的爆发

为了在小鼠脑中直接检测胶质母细胞瘤相关的显著突变基因功效，，，，作者开发了一套基于AAV载体和CRISPR手艺的在体扫描战略，，，，直接在小鼠脑原位构建胶质母细胞瘤模子（图1）。 。。。


图1 AAV-CRISPR筛选战略

通过将抑癌基因（mTSG）库（该库包括针对Trp53的sgRNA，，，，用于增进小鼠组织的肿瘤爆发，，，，亦包括其他的显著突变基因靶点sgRNA）注射到脑中，，，，配合MRI扫描，，，，作者发明注射mTSG库的动物显着泛起了肿瘤，，，，且动物的生涯周期亦显着降低（图2）。 。。。这说明AAV-CRISPR战略能够在小鼠体内诱导肿瘤的爆发。 。。。

图2 注射mTSG突变库的小鼠脑中 显着泛起了肿瘤 2. AAV-mTSG注射的小鼠脑肿瘤展现了胶质母细胞瘤的特点

通过免疫组化实验，，，，作者发明AAV-mTSG注射的小鼠所爆发的肿瘤很是显着，，，，其特征与人类胶质母细胞瘤患者的肿瘤特征很是像，，，，提醒AAV-mTSG乐成诱导了胶质母细胞瘤模子（图3）。 。。。


图3 AAV-mTSG注射的小鼠脑肿瘤展现了胶质母细胞瘤的特征 3. 靶向测序手段筛选到多个胶质母细胞瘤突变基因

构建模子的目的在于找到肿瘤爆发的要害分子靶点，，，，为了抵达此目的，，，，作者应用靶向获取测序（Targeted-capture sequencing）的手段，，，，在AAV-mTSG鼠的脑中筛选到了若干突变基因（图4）。 。。。


图4 使用对sgRNA的靶向测序手段筛选到的若干胶质母细胞瘤要害基因突变

通过癌症图谱剖析，，，，以及与耶鲁大学胶质瘤细胞库的比对，，，，作者剖析了突变基因的功效，，，，作者证实AAV-CRISPR系统构建的原位胶质母细胞瘤小鼠模子能够定量发明要害的肿瘤抑癌基因靶点（图5）。 。。。


图5 癌症图谱剖析肿瘤爆发的要害突变基因 4. 并发突变剖析（Co-mutation）发明高频并发基因

通过并发突变剖析，，，，作者从总计1540对潜在突变基因中筛选到76对具显著意义的突变基因，，，，且这些基因也同时在人胶质母细胞瘤患者脑中爆发配合突变（图6），，，，例如RB1和TP53, PTEN和RB1, RASA1和STK11等配合突变。 。。。

图6 并发突变剖析找到同时突变的要害基因 5. sgRNA Minipool手艺验证突变靶点

接下来，，，，作者使用sgRNA迷你突变库检测前文发明的高代表性突变基因或配合突变基因的功效，，，，战略如图7a，，，，发明多个或多对突变基因确实能够诱导胶质母细胞瘤的爆发（图7）。 。。。

图7 sgRNA Minipool手艺验证突变靶点的致癌 6. 转录组剖析胶质母细胞瘤差别突变细胞的转录特征

通过对差别突变基因导致的胶质母细胞瘤举行mRNA测序，，，，作者判断了差别突变细胞的转录特征（图8）。 。。。例如，，，，通过较量Rb1和Nf1突变细胞，，，，作者发明了616个和982个在Rb1细胞和Nf1细胞高表达的基因（图8b）。 。。。通过大宗的剖析，，，，包括配合突变，，，，他们发明Mll3突变会显着影响Nf1突变细胞的转录组表达，，，，而Zc3h13基因突变则会显着影响Rb1突变细胞的表达。 。。。


图8 转录组剖析差别突变细胞的基因表达情形 7. 转录组剖析与化学疗法耐药性

文末，，，，作者设计了药物治疗的RNA测序实验（图9），，，，效果发明Rb1突变的胶质瘤细胞中Zc3h13或Pten基因突变会增添TMZ化疗药物的耐药性，，，，这提醒未来的癌症需要思量差别突变基因的耐药性问题。 。。。


图9 转录组学剖析发明耐药基因突变 总结：

使用AAV病毒载体，，，，搭载CRISPR基因编辑手艺，，，，作者构建了一套极具特色的体内抑癌基因筛选战略，，，，为未来癌症突变基因的筛选提供了新的步伐。 。。。我们恭喜Chen教授的优异事情顺遂揭晓，，，，希望未来有更多的重磅发明能够资助人类对抗癌症。 。。。

参考文献：
[1] Chow RD, Guzman CD, Wang G, Schmidt F, Youngblood MW, Ye L, et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature neuroscience. 2017.
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